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甲醛變性電泳檢測RNA完整性

時間:2012-3-1 14:43:23作者:admin
甲醛變性電泳檢測RNA完整性

  
  一、材料、試劑和儀器
  
  1、材料:植物總RNA5-10μg
  
  2、試劑:
  
  1)加樣運載緩沖液(Loadingbuffer)
  
  50%甘油
  
  1mmol/LEDTA(pH8.0)
  
  0.25%溴酚藍
  
  25%二甲苯氰FF
  
  2)10×TAEBuffer
  
  3)5×甲醛凝膠電泳緩沖液:
  
  0.1mol/LMOPs(pH7.0)
  
  40mmol/L乙酸鈉
  
  5mmol/LDETA(pH8.0)
  
  4)甲醛,甲酰胺
  
  3、儀器:電泳裝置,紫外透射觀測儀
  
  二、實驗程序
  
  1、甲醛變性的瓊脂糖(Agarose)凝膠的配制
  
  在250mL的錐形瓶中準確稱量2gAgarose(Sigama),再加20mL10×TAEBuffer144mLDEPC處理過的雙蒸水,微波爐中化膠,待冷卻至50-60EB至終濃度≤0.5μg/mL。在通風櫥中加入36mL甲醛,放置一段時間以減少甲醛蒸汽。
  
  2RNA的甲醛變性電泳
  
  1)樣品制備
  
  RNA總量10μg
  
  甲醛凝膠電泳緩沖液4μl
  
  甲醛3.5μl
  
  甲酰胺10μl
  
  加入無菌離心管中混合,95水浴變性2min(5515min),取出后放入冰中冷卻。
  
  2)加入2μl無菌的DEPC處理的加樣運載液。(使用加樣運載液的目的有三:增大樣品密度,以確保DNA均勻進入樣品孔內(nèi);使樣品呈現(xiàn)顏色,便于加樣操作;能明確顯現(xiàn)樣品在電泳膠上的泳動位置。以0.5XTBE作電泳液時,溴苯酚在瓊脂糖中的泳動速率與長300bp的雙鏈線狀DNA相同,而二甲苯氰FF的泳動速率與長4kb的雙鏈線狀DNA相同。)
  
  3)將膠板浸沒在甲醛凝膠電泳緩沖液中,點樣前5V/cm預跑5min。點樣后3-4V/cm電泳。
  
  4)電泳結束后(溴苯酚藍遷移到約8cm),紫外燈下觀察,照相

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