液相芯片,也稱為微球體懸浮芯片(suspension array,liquid chip),是基于xMAP(flexible MultiAnalyte Profiling)技術的新型生物芯片技術平臺,它是在不同熒光編碼的微球上進行抗原抗體、酶底物、配體受體的結合反應及核酸雜交反應,通過紅、綠兩束激光分別檢測微球編碼和報告熒光來達到定性和定量的目的,一個反應孔內可以完成多達100種不同的生物學反應,是繼基因芯片、蛋白芯片之后的新一代高通量分子檢測技術平臺。迄今為止十年時間,全球已有數百套基于xMAP技術的檢測平臺用于免疫學、蛋白質、核酸檢測、基因研究等領域,該技術已成為一種新的蛋白質組學和基因組學研究工具,也是最早通過美國食品與藥物管理局(FDA)認證的可用于臨床診斷的生物芯片技術。
1 液相芯片技術的原理
液相芯片體系由許多大小均一的圓形微球(直徑5.5~5.6 μm)為主要基質構成,每種微球上固定有不同的探針分子,將這些微球懸浮于一個液相體系中,就構成了一個液相芯片系統,利用這個系統可以對同一個樣品中的多種不同分子同時進行檢測,這種被稱之為xMAP的檢測技術是1997年由美國Luminex公司開發出來的。
在液相系統中,為了區分不同的探針,每一種固定有探針的微球都有一個獨特的色彩編號,或稱熒光編碼。在微球制造過程中摻入了紅色和橙色兩種熒光染料(這兩種染料各有10種不同區分),從而把微球分為100種不同的顏色,形成一個具有獨特光譜地址的含有100種不同微球的陣列。不同顏色微球在分類激光激發下產生的熒光互不相同,這種分類熒光是識別不同微球的唯一途徑。利用這100種微球,可以分別標記上100種不同的探針分子。
檢測時先后加入樣品和報告分子與標記微球反應,樣品中的目的分子(待檢測的抗原或抗體、生物素標記的靶核酸片段、酶等)能夠與探針和報告分子特異性結合,使交聯探針的微球攜帶上報告分子藻紅蛋白,隨后利用儀器(如Luminex 100)對微球進行檢測和結果分析。Luminex 100采用微流技術使微球快速單列通過檢測通道,并使用紅色和綠色兩種激光分別對單個微球上的分類熒光和報告分子上的報告熒光進行檢測。紅色激光可將微球分類,從而鑒定各個不同的反應類型(即定性);綠色激光可確定微球上結合的報告熒光分子的數量,從而確定微球上結合的目的分子的數量(即定量)。因此,通過紅綠雙色激光的同時檢測,完成對反應的實時、定性和定量分析。
2 液相芯片技術的優點
液相芯片技術最突出的優點在于:僅需少量樣本即可同時定性、定量檢測同一樣本中的多種不同目的分子,即多重檢測(multiplexing)。具體說來,與常規免疫學或核酸檢測方法相比,液相芯片技術具有以下顯著優點。
2.1 高通量
可對同一樣本中的多種不同目的分子同時進行實時、定性、定量分析。從理論上說,如果不存在交叉反應,檢測的通量等于微球的種類數,目前最多可達到100種。這遠勝過一次只能檢測一個項目的傳統免疫分析法。
2.2 樣本用量少
由于在同一個反應孔中可以同時完成100種不同的生物學反應,所以大大節省了樣本用量,少至1μl的樣本即可檢測,非常適合分析小體積稀有樣品。
2.3 操作簡單、快速
由于是基于液相反應動力學,因此反應速度快,孵育時間比傳統的固相檢測短。進行免疫學分析時,若使用高親和力抗體,2~3 h內即完成檢測,而核酸雜交分析在PCR擴增后1 h內可得到結果。
2.4 靈敏度高
微球表面積大,每個微球上可包被100 000個捕獲抗體,如此高密度的捕獲抗體保證了能夠最大程度地與樣本中的抗原分子結合,提高檢測靈敏度。最低檢測濃度可達到0.1 pg/ml.
2.5 檢測范圍廣
可達3~5個數量級(如BioRad公司細胞因子檢測試劑盒的檢測范圍達到0.2~32 000 pg/ml,樣品無需濃縮或稀釋。
2.6 特異性強 無需洗滌就能夠自行將和微球結合的與未結合的分子區分開來,只讀取單個微球上的熒光信號,信噪比好。 2.7 準確性高 微球上的報告分子熒光強度與結合的待測分子成正比。由于液相芯片技術的檢測范圍大,因此不需要象ELISA檢測中那樣需將樣本多倍稀釋,從而減小了誤差。 2.8 重復性好 這是由于:第一,與ELISA依靠酶放大作用的比色讀數相比,液相芯片技術中的熒光讀值更加直接、穩定、靈敏;第二,每種微球檢測100個,最終取熒光強度的中值作為結果,這相當于對每個樣本重復檢測了100次,而ELISA僅為雙復孔或三復孔,因此液相芯片檢測結果的準確性和重復性是ELISA無法比擬的。 2.9 費用低 同時檢測一個樣本中的多項指標可節約時間、樣本、試劑、耗材和勞動(比ELISA法低10~100倍),降低檢測成本,同時還提高了分析效率,僅需少量樣本即可獲得大量信息。目前同時檢測10項細胞因子的液相芯片試劑的費用大約為$1300/96孔($130/項/96孔),這比檢測單項指標的ELISA試劑的成本($500/項/96孔)低得多,而且還可隨檢測指標的增加而進一步降低費用。 |